基于iTRAQ技术炎症刺激下成骨细胞分化相关蛋白组学分析及药靶蛋白Elp2功能初步研究

【摘要】背景与目的炎症影响成骨分化研究现状我国每年骨折患者约有5000万人,其中骨不连的发病率约为2%～5%。临床大部分骨不连由开放性骨折感染导致,其产生的疼痛、肢体功能和心理障碍等给患者带来极大痛苦,同时也增加患者和社会的经济负担,因此针对骨不连的机制研究成为目前的热点。骨形成过程为成骨细胞活性与破骨细胞活性相互拮抗制约、矛盾统一的平衡过程,其中成骨细胞由间充质干细胞（MSC）分化而来,主要合成骨基质；破骨细胞由骨髓单核巨噬细胞分化演变而成,主要降解骨基质。骨折愈合过程需要大量新生成骨细胞,进而加快骨质合成与钙化,增加骨体积与密度。目前对于慢性持续性炎症刺激可以促进骨吸收的相关研究已较为成熟,但慢性持续性炎症刺激在骨形成过程中对成骨细胞分化的影响,尤其对MSC分化为成骨细胞的影响至今却所知甚少。尽管学者们不断探索,然而到目前为止,炎症微环境下成骨细胞分化的调控机制仍尚未完全了解。作为机体的一种防御反应,正常生理性炎症反应有利于骨折愈合。但由于感染或其它因素等引起的长期慢性炎症反应则对骨折愈合则毫无益处。目前研究已证实类风湿性关节炎、雌激素缺乏或者老化等患者血液中肿瘤坏死因子（Tumornecrosisfactor-alpha,TNF-a）的表达量均有所提高。作为体内最重要的促炎性细胞因子之一,TNF-α除参与介导免疫应答外,还通过诱导局部炎症反应和调节外周组织细胞的增殖、分化、凋亡和功能活性影响组织器官的发育和功能。而TNF-α对成骨细胞功能的调节则表现在以下几个方面：（1）TNF-α直接抑制成骨细胞的分化成熟及成骨；（2）TNF-α刺激成骨细胞分泌破骨性调节因子进而促进骨吸收；（3）TNF-α诱导成骨细胞凋亡、减少其数目从而抑制骨形成；（4）TNF-α影响其他促分化细胞因子或生长因子对成骨细胞的调节作用。体外实验目前已证实TNF-α可抑制成骨细胞关键的转录因子如Runx2和Osterix因子的表达。其中TNF-α对Runx2的抑制作用主要通过造成Runx2mRNA的失稳定进而影响细胞凋亡；并且TNF-α还通过对成骨细胞内的Smurfl和Smurf2因子的增量调节来促进Runx2的降解。而TNF-α对Osterix抑制则通过独立的机制,即通过包括MAPK,神经酰胺和氧自由基等信号传导通路间接抑制Osterix活性,进而抑制成骨细胞分化。尽管如此,TNF-α抑制成骨细胞的机制复杂仍不甚清楚。因此探索炎症刺激影响成骨细胞分化的机制,寻找潜在的理想药靶阻止炎症因子对骨再生的抑制,一直是该研究领域密切关注并亟待解决的问题。蛋白质组学在成骨分化研究方面的研究炎症刺激作用下成骨细胞分化的过程存在复杂精密的调节体系,涉及诸多信号通路的调控。考虑到信号通路之间存在的交谈（crosstalk）作用,加之既往研究多通过某一条或某几条通路入手,因此难以全面地解释成骨细胞在炎症刺激作用下的分化过程。同时前期的研究多数通过单个靶点阻断单一信号通路干预炎症对成骨细胞分化的抑制。而多靶点组成的靶场干预应该是阻止炎症因子对骨再生抑制的发展方向。只有通过对炎症刺激影响成骨细胞分化的机制深入了解,发现潜在的特异性和可药性靶标,才能做到有的放矢,针对组合靶标开发新的促进炎症刺激下成骨细胞分化的药物。后基因组时代,蛋白质作为生物功能的执行者已经成为生命科学领域的研究热点。蛋白质组学是对机体、组织或细胞的全部蛋白质的表达水平、蛋白修饰与功能、蛋白之间的相互作用等进行高通量的筛选和分析,比传统的单个基因研究或单个蛋白研究更能增加疾病诊断、预后判断的可靠性,更能够准确反映机体的状态。如果运用传统的生化技术手段一个个地去研究这些蛋白质,工作量非常巨大,几乎不可能完成,而找到一些新的发病机理就显得更加困难。因此作为一种全新的系统生物学研究方法,蛋白质组学技术为揭示炎症影响成骨细胞分化的机制提供了强有力的帮助。目前在成骨细胞的研究方面,蛋白质组学分析主要集中于两类内容：1)间充质干细胞定向成骨细胞分化的蛋白质组学分析,找到差异表达的蛋白并进行机制探索；2)利用试验动物,研究各种生物及机械刺激对成骨细胞的形成以探讨成骨细胞的各种反应机制。以上成骨细胞的蛋白质组学研究取得了很多进展与突破,初步揭示了成骨细胞形成的部分分子机制,发现了一些与成骨细胞分化的相关蛋白。但上述研究缺乏动态性,考虑到成骨细胞分化的发展进程中,蛋白质表达为高度动态变化过程,单个时间点的研究难以获得系统全面的蛋白变化信息。同时针对炎症刺激作用下成骨细胞分化过程中蛋白的差异表达的研究尚未见报道。本课题从成骨细胞正常分化及炎症微环境下分化的生物学差异出发,利用高通量的iTRAQ技术联合质谱鉴定的蛋白质学策略,动态研究并筛选与炎症刺激下成骨细胞分化相关的蛋白,并对该蛋白的功能进行验证,研究结果为探索炎症微环境下成骨细胞分化机制及寻找特异性和可药性的组合药靶治疗提供新思路和理论依据。本论文主要包括以下四章内容：第一章炎症刺激下成骨细胞分化细胞模型建立及验证本章实验主要以TNF-a作为刺激物、BMP-2诱导C2C12肌源细胞分化形成成骨细胞构建炎症刺激下的成骨细胞分化模型,通过组织化学染色检测ALP活性和ALP荧光定量分析验证模型的有效性,为我们下一步蛋白组学分析奠定实验基础。第二章基于iTRAQ技术的炎症刺激下成骨细胞分化相关蛋白组学分析为了更好的理解炎症刺激下成骨细胞分化机制,寻找干预炎症微环境下成骨细胞分化的特异性和可药性的组合药靶,本实验运用采用iTRAQ化学标签分别对炎症刺激组和正常分化组蛋白样品的酶解肽段进行标记,并进一步对混合标记样品进行多维液相色谱分离-串联质谱鉴定的技术路线筛选潜在的可能与炎症刺激下成骨细胞分化过程相关的差异蛋白。并对差异蛋白进行生物学分析,探讨差异蛋白在参与炎症刺激下成骨细胞分化过程可能发挥的作用。第三章炎症刺激下成骨细胞分化相关差异蛋白的表达验证不同水平的验证研究可以更加完整地认识炎症刺激下成骨细胞分化机制以及药靶蛋白的开发。本部分研究工作采用采用基于质谱的多反应监测（MultipleReactionMonitoring,MRM）技术,Q-PCR和WesternBlotting对候选蛋白ELP2和SERCA3进一步表达验证,提供证据证明在其在炎症环境下成骨细胞分化过程中具有重要作用。第四章候选药靶蛋白ELP2生物学作用的基本机制探讨ELP2又命名为STAT3-interactingprotein1（StIP1），调控STAT3信号通路。蛋白质组学筛选并鉴定发现ELP2在正常成骨细胞分化过程中表达上调,而在炎症刺激下表达下调。目前其对炎症刺激下成骨细胞分化的影响尚未见报道。为探讨ELP2对炎症刺激对成骨细胞分化的影响,构建靶向ELP2的SiRN进行基因沉默,探讨靶向ELP2的SiRNA对成骨细胞分化的影响。沉默ELP2后能够明显改善TNF-α对BMP-2诱导成骨分化的抑制。本实验为揭示炎症刺激下成骨细胞分化机制,寻找特异性和可药性的药靶蛋白提供了新的思路。材料方法：1.细胞株：小鼠肌源细胞株C2C12（ATCCCRL-1772）。口2.细胞模型：细胞分为四组,加入不同刺激物继续培养。1)对照组：细胞悬液中不加入任何药品；2)BMP-2组：在细胞悬液培养体系中加入l00ng/mlBMP-2;3)TNF-α组：将浓度为5ng/ml的TNF-α与细胞悬液一起孵育；4)BMP-2+TNF-α组：在培养体系中同时加入上述浓度的BMP-2和TNF-α。3.碱性磷酸酶（ALP）荧光活性测定及染色测定：为了比较细胞成骨分化情况,将细胞分别按5×103个/孔接种于24孔板内,细胞培养3天后细胞溶解,ALP活性用荧光检测试剂盒检测,采用PNPP法测定碱性磷酸酶活性反映成骨细胞分化程度。波长选择405nm,酶联免疫检测仪测定各孔光密度值并记录结果。细胞培养7天后细胞溶解,进行ALP染色测定（按照AlkalinePhosphataseStainingKit操作说明进行）。4.基于iTRAQ技术筛选差异蛋白：细胞蛋白提取及定量后,完成iTRAQ试剂的标记及检测,预备LC/MS/MS分析用混合样品,经过强阳离子（SCX）交换、反相液相色谱分离后进行ESI质谱鉴定。对质谱数据分析进行蛋白的检索和鉴定,完成差异蛋白的筛选。5.差异蛋白生物学分析：对差异蛋白进行分子功能（MolecularFunction）、所处的细胞位置（CellularComponent）、参与的生物过程（BiologicalProcess）的GO分析、COG注释以及GO富集分析,寻找与差异蛋白质显著相关的生物学功能。完成蛋白质-蛋白质相互作用分析,并通过Pathway显著性富集能确定差异蛋白参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。6.炎症刺激成骨细胞分化过程中差异蛋白筛选：依据模式识别和数据挖掘的聚类分析以及总体差异蛋白的交集处理,筛选参与炎症影响成骨细胞分化过程中的差异蛋白。7.MRM：目标蛋白Transition筛选后基于MRM+EPI模式对transition的色谱峰进行验证,过MRM检测目标蛋白子离子的峰强度,整合计算离子峰面积的大小,从而可以比较目标蛋白在不同样本中的表达差异。8.WesternBlotting:抽提细胞总蛋白,采用BCA法进行蛋白浓度测定,10%SDS-PAGE电泳、转膜、免疫杂交、显影及定影。9.RT-PCR:抽提细胞总RNA,逆转录成cDNA后采用sybgreen法完成PCR扩增。以2-ΔΔCt值代表基因的相对表达强度进行相对定量。10.siRNA靶序列的设计合成及转染：根据靶基因ELP2mRNA序列设计并合成3对得分最高的靶向ELP2基因的siRNA。C2C12细胞于含10%FBS的DMEM培养液,37℃,5%CO2的温箱中培养。转染前一天用不加抗生素的培养基培养,当细胞汇合度达30%～50%时采用脂质体法将化学合成siRNA转入C2C12细胞,倒置荧光显微镜下观察绿色荧光。11.统计分析：采用SPSS13.0统计软件包进行数据处理。多组均数比较采用单向方差分析,多重比较方差齐性时采用LSD法,方差不齐时采用Dunnett’sT3法。检验水准α=0.05。结果1.炎症刺激下成骨细胞分化细胞模型建立及验证：单独或联合应用BMP-2与TNF-α成骨细胞的成骨活性差异有统计学意义（F=134.18,P=0.00）。与对照组相比,单独应用BMP-2可显著增加成骨细胞的成骨活性（P=0.01）；与BMP-2组相比,TNF-α可显著降低成骨细胞的成骨活性（P=0.00）；联合应用BMP-2和TNF-α与单独应用BMP2相比较,差异有统计学意义（P=0.01）,联合应用BMP-2和TNF-α与单独应用TNF-α相比较,差异有统计学意义（P=0.02）。结果显示TNF-α可显著抑制BMP-2诱导的成骨细胞分化。2.ITRAQ试剂标记四组C2C12肌原细胞（Control,BMP-2,TNF-α,BMP-2+TNF-α）LCMS/MS鉴定分析出365,226个质谱,其中得到21,807个肽段以及4,822个差异蛋白点。其中最终达到严格定量标准（比值≥1.5或≤0.6）的差异蛋白点：正常组与分化组（aN113-VS-bB114）22个,分化组中上调7个,下调15个；对照组与炎症组（aN113-VS-cT115）33个,炎症组中上调25个,下调8个；分化组与分化炎症组（bB114-VS-dBT118）71个,分化炎症组中上56个,下调15个。最终交集处理筛选得到5个炎症刺激成骨细胞分化过程中的差异蛋白,即S100-A4,ATPaseinhibitor（mitochondrial）,Cytochromeb5,SERCA3和ELP2。其中S100-A4,ATPaseinhibitor（mitochondrial）,Cytochromeb5和ELP2在正常分化过程中下调而在炎症刺激的分化过程中上调；SERCA3在正常分化过程中上调而在炎症刺激的分化过程中下调。3.炎症刺激下成骨细胞分化相关差异蛋白的表达验证结果：采用MRM技术、WesternBlotting以及RT-PCR对进行表达验证,结果显示ELP2在正常成骨细胞分化过程中表达上调,而在炎症刺激下表达下调；SERCA3在正常成骨细胞分化过程中表达下调,而在炎症刺激下表达上调。其中RT-PCR结果显示单独应用BMP-2或BMP-2联合应用TNF-α后ELP2的表达量差异有统计学意义（F=94.33,P=0.00）。与对照组相比,单独应用BMP-2可显著降低ELP2的表达量（P=0.00）；与BMP-2组相比,BMP-2联合应用TNF-a后ELP2的表达量显著升高（P=0.00）。同样,单独应用BMP-2或BMP-2联合应用TNF-a后ATP2A3的表达量差异有统计学意义（F=88.54,P<0.00）。与对照组相比,单独应用BMP-2可显著升高ATP2A3的表达量（P=0.00）；与BMP-2组相比,BMP-2联合应用TNF-a后ATP2A3的表达量显著降低（P=0.00）。表达验证的总体结果与质谱鉴定结果一致。4.靶向ELP2的SiRNA对成骨细胞分化的影响：设计合成ELP2siRNA靶序列,将3对靶向ELP2的siRNA以及阴性对照siRNA分别转染正常C2Cl2细胞,WesternBlotting检测转染后ELP2蛋白水平的改变。与对照组相比,在正常C2Cl2细胞中转染Si-ELP2-1干扰序列的ELP2siRNA后,ELP2在蛋白水平的表达量显著降低。ALP荧光活性定量分析可见,转染siRNA-NC或ELP2siRNA后成骨细胞的成骨活性差异有统计学意义（F=33922.40,P=0.00）。经多重比较显示：与对照组相比,单独应用BMP-2可显著增加成骨细胞的成骨活性（P=0.00）；与BMP-2组相比,联合应用TNF-a及siRNA-NC后可显著降低成骨细胞的成骨活性（P=0.00）,ALP活性由9.4倍降至2.8倍；与联合应用TNF-a及siRNA-NC组相比,联合应用TNF-a及ELP2siRNA后可显著增强成骨细胞的成骨活性（P=0.00）,转染ELP2siRNA能够显著对抗TNF-a抑制BMP-2-诱导的ALP活性,ALP活性恢复至5.7倍。结论1.TNF-a作为刺激物、BMP-2诱导C2Cl2肌源细胞分化为成骨细胞的炎症刺激下成骨细胞分化模型经验证有效。2.筛选得到5个炎症刺激成骨细胞分化过程中差异蛋白,即S100-A4,ATPaseinhibitor（mitochondrial）,Cytochromeb5,SERCA3和ELP2。其中S100-A4,ATPaseinhibitor（mitochondrial）,Cytochromeb5和ELP2在正常分化中上调,而在炎症刺激分化中下调；SERCA3在正常分化中下调,而在炎症刺激分化中表达上调。3.MRM,WesternBlotting以及RT-PCR验证ELP2与SERCA3的表达趋势与iTRAQ鉴定结果一致。4.沉默ELP2表达可以改善炎症刺激对成骨细胞分化的抑制。ELP2可以作为一个理想的药物靶点改善炎症相关性成骨分化抑制疾病。
【作者】许长鹏；
【导师】余斌；
【作者基本信息】南方医科大学，骨外科学（专业学位），2014，博士
【关键词】成骨细胞；TNF-α；ELP2；iTRAQ；蛋白组学；

【参考文献】
[1]张小勇.兰州供电公司生产管理标准化体系研究[D].兰州大学,工商管理,2012,硕士.
[2]张庆灵,戴冠中,徐心和,谢绪恺.离散广义系统稳定性分析与控制的Lyapunov方法[J].自动化学报,1998,05:48-55.
[3]李健.论预备犯的可罚性范围[D].西南政法大学,刑法（专业学位）,2012,硕士.
[4]肖立新.大学生网络素养及其培育问题研究[D].河北师范大学,马克思主义理论与思想政治教育,2012,硕士.
[5]蔡慧萍.几类有向图的控制数[D].新疆师范大学,应用数学,2013,硕士.
[6]时毓瞳.关系网络对技术创业资源获取的影响作用研究[D].吉林大学,技术经济及管理,2013,硕士.
[7]徐梦萍,许红.地铁网络化运营乘客信息需求研究[J].都市快轨交通,2014,06:79-82.
[8]钟志杰.基于“云外包”模式的粮情测控系统设计与实现[D].安徽大学,通信与信息系统,2014,硕士.
[9]廖小龙.中铁西北科学研究院有限公司全面预算管理体系构建研究[D].兰州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[10]李晖.情感和运动不惜任何代价[D].安徽师范大学,美术学,2004,硕士.
[11]邹慧琦.美国政府绩效评估制度及其对我国的启示[D].广西师范大学,宪法学与行政法学,2013,硕士.
[12]黄红梅.基于电力线和嵌入式WebServer的信息家电组网研究[D].广东工业大学,计算机应用技术,2004,硕士.
[13]董佳琦.基于曲面分片的五轴刀具轨迹规划研究[D].广东工业大学,机械电子工程,2013,硕士.
[14]卢中.论隐喻的文化内涵及其翻译[D].江西师范大学,英语语言文学,2004,硕士.
[15]覃庆努.复杂系统可靠性建模、分析和综合评价方法研究[D].北京交通大学,2013.
[16]胡聚豪.城市污泥固化技术及影响因素的试验研究[D].浙江工业大学,2013.
[17]舒明全.高校图书馆面向用户的数字化信息资源组织与服务[D].武汉大学,2004.
[18]胡秀强.低渗特低渗储层活性剂驱油效果评价研究[D].西北大学,石油与天然气工程（专业学位）,2014,硕士.
[19]蒋燕燕.亚麻籽对豁眼鹅的繁殖性能、蛋品质及子代1日龄雏鹅相关脂质代谢的影响[D].河南农业大学,动物营养与饲料科学,2012,硕士.
[20]高浩,冷文浩,须文波.一种全局收敛的PSO算法及其收敛分析[J].控制与决策,2009,02:196-201.
[21]孙强.中国企业跨国并购遭遇国家安全审查风险及规避措施研究[D].湖北大学,国际经济与贸易,2011,硕士.
[22]高博.叶片式抛送装置内流场分析[D].内蒙古工业大学,机械工程,2013,硕士.
[23]李琳.论房地产广告的社会建构[D].吉林大学,传播学,2014,硕士.
[24]王潇童.大连市农村社区建设的现状与对策研究[D].大连理工大学,公共管理（专业学位）,2012,硕士.
[25]田龙.农民工养老保险模式探究[D].山东财经大学,社会保障,2014,硕士.
[26]唐金凤.自适应技术在配电线路保护中的应用研究[D].广东工业大学,电气工程,2014,硕士.
[27]龙霞.三维编织（方型）异型结构件计算机辅助设计（CAD）系统[D].天津工业大学,计算机应用技术,2004,硕士.
[28]郭鹏.固相萃取技术在人血中提取毒品的应用[D].长春工业大学,化学工程,2013,硕士.
[29]王欣文.宝鸡市金台区城乡居民人名文化对比研究[D].西安外国语大学,语言学及应用语言学,2014,硕士.
[30]范海宏,王为民,李斌斌,杨爱武.利用TG-FTIR系统研究氧气浓度对污泥干化焚烧的影响[J].硅酸盐通报,2014,04:858-862.
[31]孙文娟.肥胖症患者血浆nesfatin-1水平的研究[D].青岛大学,护理学,2013,硕士.
[32]王颖异.农村居民房屋抵押法律问题研究[D].西南大学,法学,2013,硕士.
[33]李传才.履带式装甲车辆悬挂性能研究与仿真[D].中北大学,火炮、自动武器与弹药工程,2013,硕士.
[34]迟永宁,王伟胜,刘燕华,戴慧珠.大型风电场对电力系统暂态稳定性的影响[J].电力系统自动化,2006,15:10-14.
[35]刘敏华,萧德云.基于相似度的多传感器数据融合[J].控制与决策,2004,05:534-537.
[36]李春燕.货物列车制动限速问题[J].铁道机车车辆.1997(02)
[37]谭静.黄芩苷对TGF-β_1诱导的人肾小管上皮细胞转分化中Smad3、Smad7表达的影响及意义[D].新乡医学院,内科学,2012,硕士.
[38]邢展铭.高速铁路用混凝土声屏障研究与优化[D].西南交通大学,市政工程,2013,硕士.
[39]鹿晓雪.阿多诺意识形态批判语境下的现代主义文论观[D].华中师范大学,文艺学,2013,硕士.
[40]杨笛.模拟招聘中招聘者的性格偏向和学业成绩偏向对求职者评分影响的实证研究[D].重庆大学,应用心理学,2014,硕士.
[41]李永宏.内蒙古草原植物的生态替代及其对全球变化了草原动态的指示[J].植物生态学报,1996,03:193-206.
[42]张志佳,王博实,李雅红,齐芳,张威.基于双视角的可见外壳三维重建研究[J].计算机技术与发展,2015,03:.
[43]户月.宫腔镜电切术治疗子宫内膜息肉120例临床分析[D].河北医科大学,妇产科学（专业学位）,2014,硕士.
[44]杨建华.房地产开发项目目标成本管理研究[D].重庆大学,建筑与土木工程（专业学位）,2014,硕士.
[45]本刊讯.开放教育资源与教学改革国际研讨会五月在浙江大学召开[J].开放教育研究,2014,02:63.
[46]朱思建.基于开源系统的无线传感器网络组网的研究[D].湖北工业大学,机械制造及其自动化,2014,硕士.
[47]赵录生.基于系统视角下医药产业集团管控体系研究[D].天津大学,高级工商管理,2013,硕士.
[48]褚鹏.基于Android移动平台的图书借阅与管理系统设计与实现[D].华中师范大学,电子与通信工程,2014,硕士.
[49]寿庆华.工程项目人力资源管理模式与绩效评价研究[D].浙江工业大学,2009.
[50]吴丽佳.应对独生子女家庭风险的社会政策研究[D].苏州大学,社会工作（专业学位）,2014,硕士.